A leucemia linfóide aguda (LLA) é uma neoplasia maligna de linfócitos, caracterizada pelo acúmulo de células sanguíneas imaturas na medula óssea. Um dos medicamentos utilizados no tratamento da LLA é a enzima L-Asparaginase. Algumas linhagens de células tumorais não são capazes de produzir asparagina, assim, a redução dos níveis plasmáticos do aminoácido implica na inibição da síntese de proteínas das células leucêmicas. Atualmente, estão disponíveis apenas enzimas de origem bacteriana para serem utilizadas na clínica, o que reflete na grande taxa de efeitos adversos relacionados ao tratamento. Neste sentido, a busca por novas fontes de L Asparaginase torna-se imprescindível. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar a produção de L-Asparaginase por fungos filamentosos isolados do bioma Cerrado brasileiro. Inicialmente, foi realizada a padronização do preparo da amostra e da metodologia para determinação da atividade enzimática, onde foram utilizadas a enzima padrão (Sigma-Aldrich) e a cepa de um conhecido produtor de L-Asparaginase, o Aspergillus terreus. Posteriormente, foram isolados 42 cepas fúngicas a partir do bioma Cerrado brasileiro. Das 42 cepas isoladas, 22 apresentaram halo vermelho, o que pode indicar a produção de L-Asparaginase. Essas 22 espécies foram cultivadas em meio líquido e apenas 10 apresentaram resultados positivos para produção enzimática. Em seguida, as 3 melhores cepas produtoras foram cultivadas em diferentes condições de cultivo a fim de melhorar a produção de L-Asparaginase. Com relação às fontes de carbono, a utilização de glicose foi essencial para a produção enzimática. A L-Prolina parece ser a fonte de nitrogênio mais eficaz para que a produção de L-Asparaginase ocorra. Foram encontrados ainda, diferentes valores de pH ótimos de cultivo pelas diferentes cepas fúngicas.