A enzima L-asparaginase tem sido utilizada com sucesso no tratamento de neoplasia maligna, como a leucemia linfoblástica aguda. Porém, com o desenvolvimento tecnológico, a busca por novas fontes de L-asparaginase tem se tornado cada vez mais atraente. Nesta direção, o objetivo deste trabalho foi estudar a produção e purificação de uma L-asparaginase fúngica através de um sistema micelar de duas fases aquosas (Triton X-114/Tampão). O fungo codificado como 2DSST1 foi isolado do solo do Cerrado. Um delineamento de Plackett-Burman foi utilizado para determinar os efeitos de 11 variáveis na produção de L-asparaginase, seguido por um planejamento com composto central e um planejamento fatorial 24 completo. As variáveis avaliadas foram L-asparagina (X1), L-prolina (X2), farelo de trigo (X3), caldo de batata-dextrose (X4), sulfato de amônio (X5), temperatura de incubação (X6), tempo de fermentação (X7), pH inicial do meio de cultura (X8), extrato de levedura (X9), sacarose (X10) e concentração de glicose (X11). O ensaio de asparaginase foi realizado avaliando a formação de β-hidroxamato aspártico. Um delineamento com composto central para os sistemas micelares de duas fases aquosas foi realizado em dois níveis (+1 e -1), utilizando-se a concentração de Triton X-114 (p/v), a temperatura da fase de separação e a concentração do extrato bruto (p/v). O coeficiente de partição de L-asparaginase (K) foi considerado como variável dependente (resposta) do planejamento experimental. 64 corridas foram realizadas e a atividade máxima (2,33 UI/mL) foi encontrada no ponto central do planejamento fatorial. As variáveis positivas significativas em um nível de confiança de 95% (L-asparagina, L prolina, caldo de dextrose de batata e sacarose) foram avaliadas em 2 níveis (+1 e -1) com triplicatas no ponto central. Foram preparados 16 sistemas, 3 pontos centrais, 5 pontos axiais e 10 pontos fatoriais. O sistema 8 foi considerado o mais promissor, considerando o fator de purificação de 1,4 e o rendimento de 100%, indicando que não houve perda enzimática. Além disso, o valor de K de 0,07 indica a migração da L-asparaginase principalmente para a fase pobre em micelas do sistema. Este é o primeiro relato de um sistema micelar aplicado na pré purificação de uma L-asparaginase fúngica.