As infecções fúngicas são responsáveis por grandes agravos à saúde humana e acometem principalmente pessoas imunocomprometidas. Mundialmente, tem-se observado o aumento na incidência das infecções fúngicas e de cepas resistentes aos agentes antifúngicos utilizados na terapia. Diante desse panorama, faz-se necessária a busca por novos recursos terapêuticos. Uma importante fonte de novas susbtâncias são os metabólitos secundários vegetais. Desse modo, este trabalho avaliou a atividade antifúngica de 183 extratos vegetais pertencentes ao Banco de Extratos do Bioma Cerrado do Laboratório de Farmacognosia da Universidade de Brasília. A concentração inibitória mínima (CIM) em leveduras e fungos filamentosos foi determinada utilizando as técnicas de microdiluição descritas nos protocolos do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Todas as espécies estudadas apresentaram em pelo menos um dos seus extratos forte atividade antifúngica (CIM ≤ 125 μg/mL). O extrato etanólico da casca da raiz de Matayba guianensis foi selecionado para o estudo fitoquímico considerando a atividade antifúngica, a quantidade disponível no Banco e os resultados das revisões bibliográficas. Foram isoladas as substâncias inéditas, denominadas matayosídeo E (1) e matayosídeo F (2), e as substâncias conhecidas cupaniosídeo (3) e estigmasterol (4). A atividade das substâncias 1, 2 e 3 foi avaliada em Candida parapsilosis ATCC 22019 e em células mononucleadas de sangue periférico humano. Os matayosídeos E e F apresentaram atividade antifúngica e ausência de citotoxicidade. Os resultados encontrados reforçam a importância dos estudos com plantas do bioma Cerrado.